大鼠（Glutamate）ELISA試劑盒操作說(shuō)明

ELISA試劑盒試驗(yàn)原理：

    Glutamate試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知Glutamate濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將Glutamate和標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中Glutamate的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標(biāo)板 塊板（96T） 半塊板（48T） 即用型
塑料膜板蓋 塊 半塊 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：800umol/L 瓶（0.6ml） 瓶（0.3ml） 按說(shuō)明書進(jìn)行稀稀
空白對(duì)照 瓶（.0ml） 瓶（0.5ml） 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 瓶（4.0ml） 瓶（2.0ml） 即用型
標(biāo)記的抗Glutamate抗體 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
親和鏈酶素-HRP 瓶（8.0ml） 瓶（4.0ml） 即用型
洗滌緩沖液 瓶（20ml） 瓶（0ml） 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物A 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
底物B 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
終止液 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
標(biāo)本稀釋液 瓶（2ml） 瓶（6.0ml） 即用型

自備材料

． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul、0ul、50ul、00ul、200ul、500ul、000ul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

ELISA試劑盒安全性

． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。

2． 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項(xiàng)

． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

2． 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6． 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

9． 按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

、 血清-----操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，000×g離心0分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細(xì)胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。000×g離心0分鐘，取上清液

5、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

800 umol/L （6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400 umol/L （5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
200 umol/L （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
00 umol/L （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 umol/L （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 umol/L （號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 umol/L （空白對(duì)照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

ELISA試劑盒操作步驟

． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2． 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液：稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時(shí)。

4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5． 每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育0分鐘。避免光照。

8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。

9． 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

建議使用的實(shí)驗(yàn)方案

  標(biāo)準(zhǔn)品濃度（umol/L）  
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 00 00 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限

6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于0%。