(一)實驗方法

．細胞懸液的制備 將生長成單層的細胞，除去培養(yǎng)基，HBSS洗滌后，用0．02以EDTA或0．％溶液(無Ca 2+ 、Mg 2+之磷酸緩沖液中)37℃消化細胞。冉用HBSS浼滌次，加入適量生長用培養(yǎng)基，反復(fù)吹吸，制成單細胞懸液，并計數(shù)。

2．UDS的放射自顯影顯示法

()將單細胞懸液接種于置有小蓋玻片(8mmX 6mm)的培養(yǎng)瓶中。37℃培養(yǎng)～3d，使細胞在蓋玻片上生長至適當密度。

(2)改換同步化培養(yǎng)基(ADM補以％小牛血清)作同步培養(yǎng)3--4d。

(3)在實驗前一日下午，改換含有0mmol／。(HU)的ADM培養(yǎng)基，37℃曩續(xù)孵育6h。

(4)將上述長有細胞的蓋玻片置于含有待檢樣品或已知致癌物的同步用培養(yǎng)基(含0mmmol／L HU及5～lOμci／ml，30Ci／mmol 3 H一胸腺嘧啶核苷)中，37℃孵育5h。檢品及已知致癌物溶液在實驗時新鮮配制，以溶劑及已知致癌物為對照。

(5)孵育結(jié)束后，用HBSS充分洗滌，用％溶液處理0min，隨后用乙醇冰乙酸(3：)固定，4℃過夜。

(6)空氣中干燥后，用少量中性樹膠，將蓋玻片粘固于載玻片上，細胞面朝上，45℃烘烤24h。

(7)在暗室中，將適量乳膠移入浸漬用玻璃器皿中，置于40℃水浴中令其融化，同時取等量蒸餾水于量筒中也置于該水浴中加熱，待乳膠融化后，將熱蒸餾水傾于乳膠液中，繼續(xù)在水浴中加溫，并用玻璃棒輕輕攪拌，等待lO～20min，使氣泡逸出。在以上準備過程中，將待檢玻片置于水浴平臺上預(yù)熱。準備就緒后，將玻片垂直浸漬于：稀釋的乳膠液中約5s，徐徐提出玻片，并用紗布或擦鏡紙拭去玻片背面乳膠。

(8)將已涂有乳膠的玻片移入溫度為29℃及一定濕度的溫箱中(4h)待乳膠干涸。

(9)將玻片置于內(nèi)含適量干燥劑(變色硅膠)的曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光紙及塑料紙，置于4℃冰箱中曝光0d。

(0)曝光結(jié)束后，將玻片移人有機玻璃制成的玻片架上，在液溫為9℃的D一96顯影液中顯影5min，在停顯液中漂洗2min，在F一5定影液中定影6～lOmin，再用水漂洗數(shù)小時。

()將玻片脫水透明后，用蓋玻片封固。

(2)在顯微鏡下，每個處理組計數(shù)各樣本細胞核上的顯影銀粒數(shù)，同時計數(shù)相當面積的本底銀粒數(shù)，并自核上的銀粒數(shù)減去。計數(shù)30～50個細胞核。

3．LTDS的液體閃爍計數(shù)顯示法

()將單細胞懸液按0．5×05個／ml濃度接種于液體閃爍計數(shù)瓶中，每瓶ml，并加入4C一胸腺嘧啶核苷終濃度為O．0μci／ml(50mCi／mmol)。37℃于細胞增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h使細胞增殖并預(yù)標。

(2)去培養(yǎng)基并用HBSS洗滌后，換以含4c胸腺嘧啶核苷(O．0μci／m)的同步化培養(yǎng)基，37℃進行同步化培養(yǎng)2～4d。

(3)實驗前一日下午去培養(yǎng)基，用HBSS充分洗滌后，加入含有濃度為0mm0／L羥基碌(HU)的同步化培養(yǎng)基，37℃孵育6h。

(4)將上述長有細胞的蓋玻片置于含有Hu及3 H胸腺嘧啶核苷(5μCi／ml，30Ci／mmol)的同步化培養(yǎng)基中，與不同濃度的檢品及已知致癌物接觸5h。檢品及已知致癌物溶液在實驗時新鮮配制，以溶劑及已知致癌物為對照。

(5)孵育結(jié)束后，去培養(yǎng)基及檢品。冷鹽水洗滌2次，隨后用冰冷的O．25mol／L過氯酸溶液處理2次，每次2min，以固定細胞并除去酸可溶性成分。

(6)乙醇處理0min除去脂溶性成分及未摻入的標記物，干后以O(shè)．5～lmol／L過氨酸0.5ml，于75～80℃恒溫箱中水解40min，使摻人的標記物釋出。

(7)冷卻后加入乙二醇乙醚3．5ml及53ml閃爍液，振搖后使呈勻相，以液體閃爍計數(shù)器測定各樣本中4c及3 H的放射活性。標本中的3 H放射活性即反映UDS中3 H一胸腺嘧啶核苷的摻人量；而4 c的放射活性反映實驗細胞的數(shù)目或其DNA量，因此3 H和4c放射活性比(3 H/4 c)即為單位質(zhì)量DNA或單位數(shù)目細胞中UDS水平的反映值。

二、結(jié)果判斷

    可用Student氏“t”檢驗檢測各檢品與溶劑對照間有無顯著性差異而作出判斷。

    試驗組處理的細胞3 H一胸腺嘧啶核苷摻人數(shù)隨待檢樣品劑量增加而增加，且有統(tǒng)計學(xué)意義，或者zui小劑量組反應(yīng)陽性，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，均可判定為該試驗陽性。受試物組處理的細胞3H一胸腺嘧啶核苷摻人數(shù)不隨待檢樣品劑量增加而增加，任何一個劑量組與對照組無統(tǒng)計學(xué)上的差異，則認為受試物在該試驗系統(tǒng)不引起UDS。判定結(jié)果時，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)意義。